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獲取純化原代細胞方法合集
點(diǎn)擊次數:695 更新時(shí)間:2023-06-27

    原代細胞分離的方法有多種,常用的是機械解離細胞法、酶學(xué)解離細胞法以及螯合劑解離細胞法,下面我們就介紹酶解聚方法獲得純化的原代細胞。

1、胰蛋白酶 純化法

1)、在去除不需要的組織后,使用無(wú)菌的解剖刀和剪子把剩余的組織切成3~4 mm小片,通過(guò)懸浮在無(wú)鈣鎂的平衡鹽溶液中清洗組織碎片。讓組織碎片沉淀,去除上清液。重復清洗2到3次。

2)、將盛有組織碎片的容器置于冰上,去除殘留的上清液。加入0.25%溶解在無(wú)鈣鎂的平衡鹽溶液中的胰蛋白酶(100 mg組織加入1ml 胰蛋白酶)。

3)、在4℃孵育6到18小時(shí),使幾乎沒(méi)有胰蛋白酶活性的酶盡可能滲透進(jìn)去。

4)、移棄組織碎片中的胰蛋白酶,在37℃孵育包含殘留胰蛋白酶的組織碎片20到30分鐘。

5)、在組織碎片加入熱的*培養基,用移液管輕輕地分散組織。如果使用無(wú)血清培養基,要加入大豆胰蛋白酶抑制劑。

6)、通過(guò)無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)(100~200 mm)過(guò)濾,分散所有剩余組織。計數和接種細胞,進(jìn)行培養。


2、膠原酶純化法

1)、用無(wú)菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4 mm小片,用Hanks'平衡液(HBSS)清洗組織碎片幾次。

2)、加入膠原酶(50~200單位/ml,溶解在HBSS中)。

3)、在37℃孵育4到18小時(shí)。加入3mM CaCl2增加解離效率。

4)、通過(guò)無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過(guò)濾細胞懸液,以分離分散細胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進(jìn)一步的解聚,在碎片中加入新鮮的膠原酶。

5)、通過(guò)離心在HBSS中清洗懸液幾次。

6)、再一次在培養基中懸浮細胞,計數和接種細胞,進(jìn)行培養。


3、Dispase純化法

1)用無(wú)菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4 mm小片,用不含鈣鎂的平衡鹽溶液清洗組織碎片幾次。

2)、加入Dispase(0.6~2.4單位/ml 溶解在無(wú)鈣鎂的平衡鹽溶液)

3)、在37℃孵育20分鐘到幾個(gè)小時(shí)。

4)、通過(guò)無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過(guò)濾細胞懸液,以分離分散細胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進(jìn)一步的解聚,在碎片中加入新鮮的Dispase。

5)、通過(guò)離心在平衡鹽溶液中清洗懸液幾次。

6)、再一次在培養基中懸浮細胞,計數和接種細胞,進(jìn)行培養。


分離細胞后,首ci 傳代需要注意的問(wèn)題:

1)、傳代培養時(shí)先觀(guān)察細胞的活性。

2)、細胞的活率應該超過(guò)90%,密度控制在80%左右

3)、對于無(wú)血清培養基,需要降低胰蛋白酶使用量。

(1)、 移棄使用過(guò)的細胞培養基。

(2)、使用不包含有鈣鎂的平衡鹽溶液或EDTA清洗細胞。在培養瓶背著(zhù)細胞的一面加入清洗溶液,通過(guò)轉動(dòng)培養瓶1到2分鐘清洗細胞層,然后去除清洗液。

(3)、加入胰酶消化,消化細胞與細胞,操作手法,試劑的效價(jià)有密切的關(guān)系,消化時(shí)應注意觀(guān)察細胞形態(tài),如細胞變得橢圓透亮,并且可以觀(guān)察到細胞與細胞間的間隙時(shí),輕拍瓶身可以看見(jiàn)成流沙狀,即可中止消化,消化時(shí)盡量減少對細胞的吹打。

(4)、當細胞*分離時(shí),垂直放置培養瓶,讓細胞流到培養瓶的底部。在培養瓶中加入*培養基中止消化,計數并再次培養細胞。

(5)、對于無(wú)血清培養基,加入大豆胰蛋白酶抑制劑。通常使用1∶1(v∶v)0.25 mg/ml胰蛋白酶抑制劑到胰蛋白酶中將抑制胰蛋白酶活性。