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原代細胞分離的方法有多種，常用的是機械解離細胞法、酶學(xué)解離細胞法以及螯合劑解離細胞法，下面我們就介紹酶解聚方法獲得純化的原代細胞。
1、胰蛋白酶 純化法
1）、在去除不需要的組織后，使用無(wú)菌的解剖刀和剪子把剩余的組織切成3~4 mm小片，通過(guò)懸浮在無(wú)鈣鎂的平衡鹽溶液中清洗組織碎片。讓組織碎片沉淀，去除上清液。重復清洗2到3次。
2）、將盛有組織碎片的容器置于冰上，去除殘留的上清液。加入0.25%溶解在無(wú)鈣鎂的平衡鹽溶液中的胰蛋白酶（100 mg組織加入1ml 胰蛋白酶）。
3）、在4℃孵育6到18小時(shí)，使幾乎沒(méi)有胰蛋白酶活性的酶盡可能滲透進(jìn)去。
4）、移棄組織碎片中的胰蛋白酶，在37℃孵育包含殘留胰蛋白酶的組織碎片20到30分鐘。
5）、在組織碎片加入熱的*培養基，用移液管輕輕地分散組織。如果使用無(wú)血清培養基，要加入大豆胰蛋白酶抑制劑。
6）、通過(guò)無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)（100～200 mm）過(guò)濾，分散所有剩余組織。計數和接種細胞，進(jìn)行培養。
2、膠原酶純化法
1）、用無(wú)菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4 mm小片，用Hanks'平衡液（HBSS）清洗組織碎片幾次。
2）、加入膠原酶（50～200單位/ml，溶解在HBSS中）。
3）、在37℃孵育4到18小時(shí)。加入3mM CaCl2增加解離效率。
4）、通過(guò)無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過(guò)濾細胞懸液，以分離分散細胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進(jìn)一步的解聚，在碎片中加入新鮮的膠原酶。
5）、通過(guò)離心在HBSS中清洗懸液幾次。
6）、再一次在培養基中懸浮細胞，計數和接種細胞，進(jìn)行培養。
3、Dispase純化法
1）用無(wú)菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4 mm小片，用不含鈣鎂的平衡鹽溶液清洗組織碎片幾次。
2）、加入Dispase（0.6～2.4單位/ml 溶解在無(wú)鈣鎂的平衡鹽溶液）
3）、在37℃孵育20分鐘到幾個(gè)小時(shí)。
4）、通過(guò)無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過(guò)濾細胞懸液，以分離分散細胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進(jìn)一步的解聚，在碎片中加入新鮮的Dispase。
5）、通過(guò)離心在平衡鹽溶液中清洗懸液幾次。
6）、再一次在培養基中懸浮細胞，計數和接種細胞，進(jìn)行培養。
分離細胞后，首ci 傳代需要注意的問(wèn)題：
1）、傳代培養時(shí)先觀(guān)察細胞的活性。
2）、細胞的活率應該超過(guò)90%，密度控制在80%左右
3）、對于無(wú)血清培養基，需要降低胰蛋白酶使用量。
（1）、 移棄使用過(guò)的細胞培養基。
（2）、使用不包含有鈣鎂的平衡鹽溶液或EDTA清洗細胞。在培養瓶背著(zhù)細胞的一面加入清洗溶液，通過(guò)轉動(dòng)培養瓶1到2分鐘清洗細胞層，然后去除清洗液。
（3）、加入胰酶消化，消化細胞與細胞，操作手法，試劑的效價(jià)有密切的關(guān)系，消化時(shí)應注意觀(guān)察細胞形態(tài)，如細胞變得橢圓透亮，并且可以觀(guān)察到細胞與細胞間的間隙時(shí)，輕拍瓶身可以看見(jiàn)成流沙狀，即可中止消化，消化時(shí)盡量減少對細胞的吹打。
（4）、當細胞*分離時(shí)，垂直放置培養瓶，讓細胞流到培養瓶的底部。在培養瓶中加入*培養基中止消化，計數并再次培養細胞。
（5）、對于無(wú)血清培養基，加入大豆胰蛋白酶抑制劑。通常使用1∶1（v∶v）0.25 mg/ml胰蛋白酶抑制劑到胰蛋白酶中將抑制胰蛋白酶活性。
